Helicos Biosciences
| Helicos Biosciences | |
|---|---|
 | |
| Отрасль | биотехнологии |
Helicos Biosciences — это компания, которая предоставила революционно новую технологию секвенирования единичных молекул, названную true Single Molecule Sequencing (tSMS)[1].
tSMS позволяет проводить одновременное прямое секвенирование миллиарда цепей ДНК[1]. Процесс секвенирования включает в себя несколько этапов[2]. На первом шаге подготавливаются образцы за счет разрезания ДНК на фрагменты[2]. Далее к каждому фрагменту присоединяется полиадениновый хвост с помощью аденозин-концевой трансферазы[3]. На следующем этапе денатурированная ДНК с полиаденозиновым хвостом гибридизуется на политиминовых олигонуклеотидах, которые соединены с проточной кюветой[2]. Цикл секвенирования состоит из удлинения за счет одного из четырёх флуоресцентно-меченых нуклеотидов, присоединение которого детектируется на секвенаторе компании Heliscope[2]. Последующее отщепление флуорофора позволяет запустить следующий цикл присоединения флуоресцентно-меченых нуклеотидов, которые позволяют определить последовательность ДНК[2][4].
История
Компания Helicos Biosience была основана в 2003 году[1]. За основу tSMS™ технологии была взята работа Браславского (Braslavsky) и его коллег, посвященная секвенированию единичных молекул ДНК у человека и дрожжей[2][5]. Позже технология была усовершенствована на основе работ Озолака (Ozsolak) и Милоса (Milos), что позволило осуществлять более точный синтез гомополимеров и прямое РНК-секвенирование[2][6][7][8].
Компания создала Genetic Analysis Platform первый в мире ДНК-микроскоп. Платформа была разработана Браславским (Braslavsky) и его коллегами в 2003 году[1][3]. Преимущество этой технологии в том, что нет необходимости производить амплификацию образцов ДНК, а также в более высокой скорости секвенирования по сравнению с секвенаторами второго поколения[1][3]. Heliscope секвенатор способен секвенировать до 28 Гб одновременно и это займет около 8 дней[2]. Он генерирует короткие риды (reads) с максимальной длиной в 55 нуклеотидных оснований[2].
В ноябре 2012 года компания Helicos Biosience была признана банкротом и прекратила существование[9].
Этапы секвенирования
Процесс секвенирования включает следующие этапы:
- подготовка образцов;
- секвенирование и визуализация[10].
Подготовка образцов
Компания Helicos Biosience предоставляла две технологии подготовки образцов: one-pass sequencing и two-pass sequencing[10]. Отличительной особенностью этих методов является отсутствие стадии амплификации образцов с помощью ПЦР (Полимеразмой Цепной Реакции), при которой есть вероятность ошибки при репликации[10].
One-pass sequencing
На первом этапе праймеры, распределённые на твёрдой основе, ковалентно с ней связаны[10]. На следующем этапе образцы одноцепочечной ДНК, расщеплённые на фрагменты и к которым уже присоединены адаптеры к праймерам, гибридизуются на иммобилизованных праймерах, после чего с ними связывается ДНК-полимераза и происходит синтез[10].
Two-pass sequencing
В этом случае, сами одноцепочечные фрагменты ДНК ковалентно сшиваются с твёрдой основой с помощью комплекса стрептовидин-биотин[6] и после этого к одноцепочечным фрагментам ДНК присоединяются праймеры, с которыми может связаться ДНК-полимераза[10].
Секвенирование и визуализация
Процесс секвенирования включает следующие стадии:
- Посадка ДНК-полимеразы на праймеры;
- Присоединение только одного флуоресцентно-меченого нуклеотида, который комплементарен иммобилизованному ДНК фрагменту;
- Терминация синтеза, после присоединения одного нуклеотида;
- Смываются оставшиеся не присоединенные нуклеотиды;
- Визуализация присоединенного нуклеотида;
- Стадия расщепления, в которой удаляется ингибирующая группа и флуоресцентный краситель с помощью трис (2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP);
- Свободная сульфогидридная группа кэпируется йодоацетамидом;
- Перед началом следующего цикла снова омывают твёрдую основу с образцами[10].
Компания использует одноцветный краситель для проведения циклов[10]. Для визуализации флуоресцентного красителя используется технология TIRT (total internal reflection fluorescence), в которой присутствуют два лазера с длинами волн 635 нм и 532 нм[7][10]. Аналогичная технология используется и Illumina/Solexa геномным анализатором[10]. В качестве флуоресцентного красителя используется Cy5 краситель[10].
Применение
Продукция большого количества ридов с низкой стоимостью позволило использовать технологии секвенирования нового поколения (Next-generation sequencing) в широком круге исследований[10]. В частности технологии компании Helicos Biosience позволяют проводить следующие исследования:
- секвенирование фрагментов генома, а также всего генома различных организмов[10];
- секвенирование ДНК из костей древних животных[11];
- прямое РНК-секвенирование[10];
- секвенирование индивидуальных геномов, что вероятно может быть использовано при исследовании различных генетических заболеваний[10].
Преимущества и недостатки
Главными преимуществами данного метода являются отсутствие стадии амплификации образцов, а также достаточно высокая скорость секвенирования и более низкая стоимость по сравнению с секвенаторами второго поколения[1][3][10]. К примеру, секвенирование генома человека обходится в 48000$US[10]. Однако, у этого метода есть ряд недостатков. Например, все же остается достаточно высоким уровень ошибок по сравнению с другими секвенаторами нового поколения[10].
Примечания
- ↑ 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 PMID 18384261 (PMID 18384261)
Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота. - ↑ 2,0 2,1 2,2 2,3 2,4 2,5 2,6 2,7 2,8 PMID 21698376 (PMID 21698376)
Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота. - ↑ 3,0 3,1 3,2 3,3 PMID 21463242 (PMID 21463242)
Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота. - ↑ PMID 18388294 (PMID 18388294)
Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота. - ↑ PMID 12651960 (PMID 12651960)
Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота. - ↑ 6,0 6,1 PMID 21145465 (PMID 21145465)
Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота. - ↑ 7,0 7,1 Ozsolak F., Milos P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. (англ.) // Nature Reviews. Genetics. — 2011. — February (vol. 12, no. 2). — P. 87—98. — doi:10.1038/nrg2934. — PMID 21191423.
- ↑ PMID 21431762 (PMID 21431762)
Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота. - ↑ Battered Helicos BioSciences Corporation Files for. Дата обращения: 21 июня 2013. Архивировано 23 сентября 2015 года.
- ↑ 10,00 10,01 10,02 10,03 10,04 10,05 10,06 10,07 10,08 10,09 10,10 10,11 10,12 10,13 10,14 10,15 10,16 10,17 Metzker M. L. Sequencing technologies - the next generation. (англ.) // Nature reviews. Genetics. — 2010. — Vol. 11, no. 1. — P. 31—46. — doi:10.1038/nrg2626. — PMID 19997069.
- ↑ PMID 21803858 (PMID 21803858)
Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.